溶血卵磷脂对血管内皮细胞增殖及凋亡的影响(1)
【摘要】 目的 观测溶血卵磷脂(LPC)对血管内皮细胞增殖及凋亡的影响,从而探讨动脉硬化发生的机制。方法 取体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，在含不同浓度LPC(5、10、20 mg/L)的培养基中分别培养6、12、24、48 h，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、流式细胞仪、荧光显微镜观测血管内皮细胞增殖及凋亡的变化。结果 与正常对照组比较，LPC抑制内皮细胞增殖，促进细胞凋亡，且其作用呈时间-效应、浓度-效应依赖关系,但随着LPC浓度增加，细胞凋亡增加的同时细胞死亡比例也增加。结论 LPC抑制血管内皮细胞增殖，促进细胞凋亡，可能是其致动脉粥样硬化机制之一。
【关键词】溶血卵磷脂；人脐静脉内皮细胞；增殖；凋亡
Effects on proliferation and apoptosis of cultured human umbilical vein endothelial cells induced by lysophosphatidylcholine
, http://www.100md.com
ZHU Yun,SUN Guo-ju.Department of Geriatrics,the Fifth Affiliation Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou450052 , China
【Abstract】 Objective To investigate the effects on proliferation and apoptosis of HUVECs induced by LPC.Methods HUVECs were treated with different concertrations of LPC (5,10,20 mg/L) for 6,12,24,48 h respectively.Proliferation and apoptosis of HUVECs were assessed by MTT assay,flow cytometry (FCM)and fluorescence microscopy respectively.Results Compared with control group,LPC could inhibit the proliferation and induce apoptosis of HUVECs in a dose-dependent and time- dependent way.Meanwhile,the death of the cells was increased with the increasing of LPC concentration.Conclusion LPC could inhibit the proliferation and induce apoptosis of HUVECs,which may be one of mechanisms responsible for LPC to lead to atherosclerosis.
, 百拇医药
【Key words】Lysophosphatidylcholine；Human umbilical vein endothelial cells；Proliferation；Apoptosis
血管内皮细胞为衬覆于血管内腔面的单层扁平细胞,它依靠其正常的增殖和凋亡平衡,保证了血管的结构和功能正常。近年来的研究表明，许多心血管疾病的发生发展与细胞增殖和凋亡有关。研究显示：氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发生发展中起着重要作用[1-3]，而溶血卵磷脂(LPC)是ox-LDL的主要活性成分。目前，罕见LPC对血管内皮细胞增殖及凋亡影响的研究报道。本研究观测LPC对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响，为AS的基础研究提供新思路。
1 材料和方法
1.1 主要试剂及仪器 RPMI-1640培养基(GIBCO，USA)，胎牛血清(杭州四季青公司)，LPC、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(Sigma，USA)，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)，酶联免疫检测仪(Biotek，USA)，荧光显微镜(OLYPUS，JAPAN)，流式细胞仪(BD，USA)，低温离心机(BECKMAN，USA)，高速低温离心机(Eppendorf，USA)。
, http://www.100md.com
1.2 细胞株及细胞培养 人脐静脉内皮细胞(Human umbilicus vein endothelial cells，HUVECs)株CRL-1730购自ATCC公司。采用常规培养,将冻存的HUVECs株解冻复苏后，种植在含15%胎牛血清(FBS)、2 mol/l谷氨酰胺、0.1 mg/ml肝素、0.05 mg/ml内皮细胞生长因子的RPMI-1640培养基(Gibco)中，置于37℃、5%的CO2饱和湿度培养箱内培养，以后2～3 d/次换液。待细胞生长至单层融合状态后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。实验时所用细胞均为对数生长期。
1.3 设计分组 取对数生长期细胞，按传代方法制成单细胞悬液，进行如下分组：①正常对照组：当细胞长至60%～70%满时换5% 胎牛血清RPMI-1640培养液；②LPC低浓度组：当细胞长至60%～70%满时换含有浓度5 μg/ml LPC的5% 胎牛血清培养液；③LPC中浓度组：当细胞长至60%～70%满时换含有浓度10 μg/ml的LPC的5% 胎牛血清培养液；④LPC高浓度组：当细胞长至60%～70%满时换含有浓度20 μg/ml的LPC的5% 胎牛血清培养液。
, 百拇医药
1.4 MTT比色法分析非诺贝特对LPC诱导的内皮细胞增殖的影响 取对数生长期细胞，按传代方法制成单细胞悬液，接种于96 孔培养板，每孔加细胞悬液200 μl(相当于2×104个)，按实验要求进行分组及处理。空白对照组以无血清RPMI-1640 补足，细胞终浓度为1×105/m L，每孔总体系0.2 ml，培养时间分别为6、12、24、48 h。每孔加入0.5% MTT 20 μl，继续培养4 h 后，小心吸除孔内液体，每孔加二甲基亚砜150 μl，震荡10 min后，用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度值(A值)。以时间为横轴，A值为纵轴，绘制细胞生长曲线。实验重复3次,设3个复孔,取平均值为最终结果。
1.5 细胞凋亡的形态学观察 将HUVECs 接种于内置多聚赖氨酸处理过的载玻片的6孔板上，根据实验要求进行分组及处理。按细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒(碧云天生物技术研究所)说明书操作，荧光显微镜下观测。
1.6 流式细胞仪观察 对照AnnexinV/FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。取对数生长期细胞，按传代方法制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于6空板上，每孔加细胞悬液1 ml，按实验要求进行分组及处理后，分别收集6孔板各组各孔细胞，调整待测细胞浓度为5×105~1×106个/ ml。取1 ml细胞，1 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清。加入1 ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮。1 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清。重复两次，将细胞重悬于200 μl Binding Buffer，加入10 μl FITC-Annexin V和5 μl PI双标记后，轻轻混匀，避光室温反应15 min，立即上流式细胞仪检测，进行定量分析。, 百拇医药(朱 云 孙国举)
【关键词】溶血卵磷脂；人脐静脉内皮细胞；增殖；凋亡
Effects on proliferation and apoptosis of cultured human umbilical vein endothelial cells induced by lysophosphatidylcholine
, http://www.100md.com
ZHU Yun,SUN Guo-ju.Department of Geriatrics,the Fifth Affiliation Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou450052 , China
【Abstract】 Objective To investigate the effects on proliferation and apoptosis of HUVECs induced by LPC.Methods HUVECs were treated with different concertrations of LPC (5,10,20 mg/L) for 6,12,24,48 h respectively.Proliferation and apoptosis of HUVECs were assessed by MTT assay,flow cytometry (FCM)and fluorescence microscopy respectively.Results Compared with control group,LPC could inhibit the proliferation and induce apoptosis of HUVECs in a dose-dependent and time- dependent way.Meanwhile,the death of the cells was increased with the increasing of LPC concentration.Conclusion LPC could inhibit the proliferation and induce apoptosis of HUVECs,which may be one of mechanisms responsible for LPC to lead to atherosclerosis.
, 百拇医药
【Key words】Lysophosphatidylcholine；Human umbilical vein endothelial cells；Proliferation；Apoptosis
血管内皮细胞为衬覆于血管内腔面的单层扁平细胞,它依靠其正常的增殖和凋亡平衡,保证了血管的结构和功能正常。近年来的研究表明，许多心血管疾病的发生发展与细胞增殖和凋亡有关。研究显示：氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发生发展中起着重要作用[1-3]，而溶血卵磷脂(LPC)是ox-LDL的主要活性成分。目前，罕见LPC对血管内皮细胞增殖及凋亡影响的研究报道。本研究观测LPC对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响，为AS的基础研究提供新思路。
1 材料和方法
1.1 主要试剂及仪器 RPMI-1640培养基(GIBCO，USA)，胎牛血清(杭州四季青公司)，LPC、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(Sigma，USA)，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)，酶联免疫检测仪(Biotek，USA)，荧光显微镜(OLYPUS，JAPAN)，流式细胞仪(BD，USA)，低温离心机(BECKMAN，USA)，高速低温离心机(Eppendorf，USA)。
, http://www.100md.com
1.2 细胞株及细胞培养 人脐静脉内皮细胞(Human umbilicus vein endothelial cells，HUVECs)株CRL-1730购自ATCC公司。采用常规培养,将冻存的HUVECs株解冻复苏后，种植在含15%胎牛血清(FBS)、2 mol/l谷氨酰胺、0.1 mg/ml肝素、0.05 mg/ml内皮细胞生长因子的RPMI-1640培养基(Gibco)中，置于37℃、5%的CO2饱和湿度培养箱内培养，以后2～3 d/次换液。待细胞生长至单层融合状态后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。实验时所用细胞均为对数生长期。
1.3 设计分组 取对数生长期细胞，按传代方法制成单细胞悬液，进行如下分组：①正常对照组：当细胞长至60%～70%满时换5% 胎牛血清RPMI-1640培养液；②LPC低浓度组：当细胞长至60%～70%满时换含有浓度5 μg/ml LPC的5% 胎牛血清培养液；③LPC中浓度组：当细胞长至60%～70%满时换含有浓度10 μg/ml的LPC的5% 胎牛血清培养液；④LPC高浓度组：当细胞长至60%～70%满时换含有浓度20 μg/ml的LPC的5% 胎牛血清培养液。
, 百拇医药
1.4 MTT比色法分析非诺贝特对LPC诱导的内皮细胞增殖的影响 取对数生长期细胞，按传代方法制成单细胞悬液，接种于96 孔培养板，每孔加细胞悬液200 μl(相当于2×104个)，按实验要求进行分组及处理。空白对照组以无血清RPMI-1640 补足，细胞终浓度为1×105/m L，每孔总体系0.2 ml，培养时间分别为6、12、24、48 h。每孔加入0.5% MTT 20 μl，继续培养4 h 后，小心吸除孔内液体，每孔加二甲基亚砜150 μl，震荡10 min后，用酶标仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度值(A值)。以时间为横轴，A值为纵轴，绘制细胞生长曲线。实验重复3次,设3个复孔,取平均值为最终结果。
1.5 细胞凋亡的形态学观察 将HUVECs 接种于内置多聚赖氨酸处理过的载玻片的6孔板上，根据实验要求进行分组及处理。按细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒(碧云天生物技术研究所)说明书操作，荧光显微镜下观测。
1.6 流式细胞仪观察 对照AnnexinV/FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。取对数生长期细胞，按传代方法制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于6空板上，每孔加细胞悬液1 ml，按实验要求进行分组及处理后，分别收集6孔板各组各孔细胞，调整待测细胞浓度为5×105~1×106个/ ml。取1 ml细胞，1 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清。加入1 ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮。1 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清。重复两次，将细胞重悬于200 μl Binding Buffer，加入10 μl FITC-Annexin V和5 μl PI双标记后，轻轻混匀，避光室温反应15 min，立即上流式细胞仪检测，进行定量分析。, 百拇医药(朱 云 孙国举)